重生08：揭诺奖骗局成为医学巨擎 第140节
“好……好好，全听张君安排！”
高桥健太迅速安排下去。
张沐晨分派给其他实验员的都是些简单的辅助工作，真正的核心操作由他完成。
他双手伸入气帘防护区，在冰浴托盘中剔除多余的结缔组织。然后切取核心病变肺泡实质，投入到无菌匀浆管。
加入酚-异硫氰酸胍试剂、机械匀浆破壁、加氯仿剧烈震荡乳化、低温高速离心分层……
就在张沐晨分装反应管，准备将样品推入荧光定量PCR仪时，实验室的门忽然被打开。
高桥清一走了进来，身后跟着山本和藤田教授。
“山本教授，藤田教授，刚才在楼上不是我故意不给你们样本。时间紧迫，张君早在二十分钟前就已经开始做RNA裂解与提取了。样本一旦进入生化流程，中途转运只会增加降解风险。事关公共卫生安全，二位多见谅。”
山本教授快步走到观察窗前，推了推眼镜，看清了安全柜前的年轻背影。
“高桥教授，你让一个非专业的医生主导病毒的逆转录，太草率了吧？”
话音未落，张沐晨完成了八联管的逆转录酶预混液加样。
他扣紧管盖，放进PCR仪的反应槽中。随后脱下手套走出气帘区，对着高桥清一微微颔首：“高桥教授。”
“张君，辛苦了。”高桥清一关切的问道，“目前进度到哪一步了？”
“匀浆裂解已完成，病毒通过异硫氰酸胍化学灭活。”
“两组平行样本的总RNA沉淀复溶完毕，吸光度质检纯度良好。我刚刚完成了SuperScript逆转录体系与第一轮特异性PCR引物的配比加样，一会启动快速扩增程序。”
一旁的山本教授听得眉心一跳，立刻问道：“张医生是吧？死者是急性肺出血猝死，红细胞裂解释放的游离血红素和组织内源性RNase高，你怎么保证反转录酶不被抑制？”
张沐晨看着他，脱口而出：“抽提分相时多加了一轮酸性酚-氯仿洗涤去除残留蛋白，复溶前在DEPC水里补加了1.5倍浓度的核糖核酸酶抑制剂，模板加入前经过了65度温育五分钟解开RNA二级发卡结构。抑制物降到检出限以下，不影响后续RT效率。”
山本教授听的发愣。
纳尼？这么专业？
他挠挠头，一时间竟问不出来别的话，
急诊科的藤田教授见状，干咳一声，道：“那引物设计呢？如你扩增靶区选的哪个位点？退火温度设了多少？”
张沐晨：“退火温度设在58.5°C，采用降落PCR策略消除非特异性条带。”
“第一轮扩增靶区锁定基质蛋白M1保守片段，针对HA0裂解位点的多碱基插入区域以及PB2基因第627位毒力位点设计了两对重叠简并引物。只要扩增完成，一代测序图谱在出峰的瞬间就能判断是否存在高致病性突变。”
“那高GC含量的模板如何避免二级结构阻断聚合酶？”藤田不死心的继续问。
“体系内加入了5%的二甲基亚砜作为变性助剂，延伸时间拉长至一分半，变性温度调高至98°C。”
藤田教授：“分相离心时水相体积取了多少？界面白膜层怎么规避？”
张沐晨：“标准0.6倍上清体积，枪尖靠壁悬空吸取，留存约15%缓冲层完全弃用，未带入任何中间层脂蛋白与杂质。”
山本教授接上：“组织破碎导致局部核酸断裂，匀浆频率和间歇时间怎么控制的？”
张沐晨：“全程冰浴，匀浆器转速控制在每分钟两万转以内，单次工作十秒......”
藤田教授急忙又接上：“那沉淀洗脱呢？RNA小颗粒附着力差，乙醇洗涤时离心管方向怎么定位？干燥过度不溶怎么处理？”
张沐晨：“75%乙醇轻柔漂洗后倾倒弃液，采用室温微风干法..........”
……
快问快答。
几轮交锋下来，高桥健太和几名实验员纷纷咋舌侧目。
张沐晨的回答像喝水一样简单。
藤田教授张着嘴，喉咙里卡了半天，再也问不出专业问题。
一旁的山本教授也是愣在原地，张着嘴巴。
“两位教授，还有问题吗？没有的话我要继续试验了。”张沐晨问道。
山本教授嘴唇蠕动几下：“……没了。”
张沐晨颔首，转身回到实验台。
山本和藤田对视一眼，然后纷纷跟着张沐晨来到实验台。
理论背的滚瓜烂熟，实操可不一定过关！
两位老教授想要一睹张沐晨的实操，说不定能挽尊。
然而看着看着，两位大教授的脸逐渐凝固，变得沉默。
标准。
实在是太标准了。
加样、混匀、离心瞬沉、八联管密封......
整套动作干净利落，纯纯的老手。
“他怎么会这么熟练？”山本教授实在想不清楚。
他们不知道，前世张沐晨在攻读博士期间，主攻的课题是嗜神经病毒，包括疱疹病毒，狂犬病毒，变异流感脑病。
想要搞清楚病毒是如何穿透血脑屏障破坏神经元突触的，第一步就是在负压实验室里完成病毒RNA提取，反转录和全基因测序。
在外人看来的跨学科，对张沐晨而言不过是重操旧业罢了。
滴����
PCR扩增程序启动，仪器屏幕上跳出四十五分钟的倒计时。
藤田与山本两位教授对视一眼，默默走到实验室角的椅子上坐下。
他们要亲自在现场盯到最后一刻。
目前病毒RNA提取与逆转录已经完成，PCR扩增只是第一步。
常规的荧光PCR只能证明死者体内是否存在甲型流感病毒。但是如果想确认病毒的身份，必须把扩增产物送进毛细管测序仪，逐个碱基读取核酸序列，再接入全球流感数据库进行多序列全基因比对。
张沐晨看了一眼墙上的电子钟，道：“扩增四十五分钟，产物纯化二十分钟，毛细管电泳一个小时。最多两个半小时，比对图谱就出来了。”
……
滴����！
“测序数据采集完毕，正在接入NCBI GenBank和GISAID数据库执行BLAST序列对齐。”
系统播报声响起。
山本与藤田快步来到测序仪的屏幕前。
屏幕之上，红、绿、蓝、黑四种颜色叠出Sanger测序荧光峰。
BLAST进度条拉满。
张沐晨将核酸序列翻译成氨基酸序列，逐段比对解析。
【核酸序列比对：和已知季节性 H1N1、H3N2最高同源性仅 84.6%，未找到完全匹配毒株】
【HA0裂解区：检出连续碱基插入，翻译后出现��R��X��R/K��R��多碱性氨基酸基序】
【PB2蛋白第 627位：氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸 E627K】
“这……这是什么？”
山本教授盯住碱基序列，皱眉：“血凝素HA0裂解位点被插入了一整段连续碱基？只能被呼吸道单核胰蛋白酶切割的受体居然能被全身所有组织的弗林蛋白酶裂解？”
“还有PB2的第627位谷氨酸直接突变成了赖氨酸……”
藤田教授吸了口气，后背发凉：“这种突变只会出现在高致病性禽源重配株上……这意味着它在人类上呼吸道环境里的复制效率暴增了上百倍........难怪急诊那些人的肺部会在四十八小时内白化........”
这不什么换季常规流感，是新型毒株！
全基因同源性仅有84.6%。
两位教授大脑一片空白。
他们无法想象，如果今天没有张沐晨在，几天后的东京医疗系统将会迎来何等灾难。
高桥清一伸手放在山本与藤田的肩膀上。
“现在，立刻以东大医学部的名义向厚生劳动省与东京都厅启动特级公共卫生应急响应！”
“灾难要来了！”
..........
第130章 零号病人？
次日，晨间新闻。
【速报：东京都确认一例不明重症流感猝死病例】
【速报：东大医学部检出该病例毒株与已知季节性流感同源性偏低，疑似全新变异毒株，国立感染症研究所正在复核确证】
【速报：死者家属及接诊急诊医护等密切接触者，多人检出流感病毒基因，初筛阳性待确诊】
【速报：厚生劳动省、东京都紧急设立感染症对策本部，发布流感流行早期警戒，启动全域扩散防控机制】
涩谷十字路口，新宿车站，各大商场的户外大屏都在播放NHK电视台的特别演播室节目。
主持人：“各位观众，插播一条突发重大公共卫生通报。根据厚生劳动省刚刚召开的紧急记者会，东京都内一名因严重急性肺出血猝死的年轻男性体内，分离出一种新型甲型流感变异株。目前，与该男子有过密接接触的急诊医务人员已有多人出现高热、肺部快速渗出等症状，且初筛均已检测出同源病毒核酸……”
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